信号通路
信号通路（signal pathway，信号转导）是指通过细胞膜将胞外一些分子信号传到细胞内，细胞根据这些信号发生一系列效应的过程。信号通路的本质是对一系列效应调控方式的总结。
cGAS-STING信号通路
cGAS-STING信号通路是天然免疫系统中一条关键的“DNA感知”通路，负责识别胞质中异常存在的双链DNA（dsDNA），并触发I型干扰素和促炎细胞因子的表达，从而发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。
cGAS-STING信号通路主要成员
cGAS-STING 信号通路的核心成员可按“感受器 → 第二信使 → 接头蛋白 → 激酶 → 转录因子 → 效应分子”六层结构归纳如下
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感受器（Sensor）
• cGAS（cyclic GMP-AMP synthase）：细胞质 DNA 感受器，识别 >30 bp 的双链 DNA 后催化 ATP+GTP → cGAMP
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第二信使（2nd messenger）
• cGAMP（2’3’-cGAMP）：由 cGAS生成，直接结合并激活 STING。
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接头蛋白（Adaptor）
• STING（TMEM173；Stimulator of Interferon Genes):内质网四次跨膜蛋白；cGAMP 结合后寡聚化并转位至高尔基体，形成信号平台。
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激酶（Kinase）
• TBK1(TANK-binding kinase 1):被 STING 招募后自磷酸化（Ser172），继而磷酸化 STING 和 IRF3。
• IKKε/IKKβ：可协助激活 NF-κB 途径，放大炎症反应。
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转录因子（Transcription factor）
• IRF3(Interferon regulatory factor 3): TBK1 磷酸化 IRF3-Ser396，导致其二聚并入核，启动 I 型干扰素基因。
• NF-κB(p65/p50):同时被TBK1/IKK 激活，驱动 TNF-α、IL-6 等促炎基因。
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效应分子（Effectors）
• IFN-β、IFN-α（I 型干扰素）
• CXCL10、ISG15、IFIT1 等干扰素刺激基因(ISGs）
• TNF-α、IL-6 等 NF-κB 下游炎症细胞因子
补充协同或调控分子
• IFI16 / IFI204(PYHIN 家族)—可与 cGAS 协同增强 STING 激活。
• ULK1、TRIM32、RNF185 等 E3 泛素连接酶 — 介导 STING 降解与信号关闭。
cGAS-STING信号通路的激活与调控
激活过程：
1. DNA识别（0–5 min）：cGAS识别并结合胞质中长度大于30 bp的非特异性dsDNA（如病毒DNA、肿瘤细胞基因组不稳定片段或微核破裂释放的DNA），cGAS 以 2:2 对称模式结合 dsDNA，形成“DNA-cGAS 平台”。结合后构象变化：催化口袋打开，ATP/GTP 底物通道暴露。
2. cGAMP合成（5–15 min）：cGAS催化ATP和GTP生成cGAMP。
催化反应：2 ATP + 2 GTP → 2’3’-cGAMP（非经典 3’5’磷酸二酯键）。
3. STING激活（15–30 min）：STING 胞质配体结合域（LBD）的 V147、Y167、R232 与 cGAMP 磷酸基团形成氢键网络。cGAMP结合内质网（ER）上的STING，STING 由“开放”转为“封闭”二聚体，并触发STING从内质网向高尔基体转运（30–60 min）。
4. 下游信号转导：STING招募TBK1（TANK结合激酶1）和IKK复合体（45–90 min），磷酸化IRF3（干扰素调节因子3）和NF-κB（核因子κB），促使IRF3二聚化和NF-κB入核，启动I型干扰素（IFN-α/β）和促炎细胞因子（如IL-6、TNF）的转录（60–120 min）。
终止机制（2–8 h）：
STING被ULK1/ATG1磷酸化后，通过网格蛋白包被囊泡（CCV）转运至溶酶体降解，避免过度免疫反应。
Fig. 1 Overview of the cGAS–STING pathway
图片来源：doi.org/10.1186/s12931-024-02915-x
调控机制：
1.翻译后修饰：cGAS和STING的活性受磷酸化、泛素化、SUMO化、乙酰化等多种修饰调控。例如，AKT和BLK磷酸化cGAS，RNF185介导其泛素化，而高乙酰化（如3SPF1作用）可抑制cGAS活性，用于自身免疫病治疗。
2.细胞间信号传递：在肿瘤微环境中，cGAMP、dsDNA或活化的STING可通过细胞外囊泡（如RAB22A介导的拉菲体）传递至邻近细胞，增强免疫监视。
信号通路验证
1.按时间层级验证方案总结
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时间
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分子事件
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实验方法及可检指标
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0–5 min
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DNA-cGAS 结合
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原位PLA（cGAS-DNA）
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5–15 min
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cGAMP 生成
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LC-MS/MS cGAMP
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15–30 min
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STING 构象/棕榈酰化
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非还原胶寡聚体
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30–60 min
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STING 转运
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免疫荧光 ER→高尔基体
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45–90 min
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p-TBK1、p-STING
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Western blot
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1-2h
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p-IRF3 二聚体
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超迁移EMSA/Native-PAGE
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2–8 h
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IFN-β、ISG 表达
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ELISA/IFN-β-Luc报告基因
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2.WB在蛋白水平的验证方法
使用WB验证cGAS-STING 信号通路，需检测cGAS、STING（总+磷酸化）、TBK1（总+磷酸化）、IRF3（总+磷酸化） 这 6 个关键条带，再配一个阴性/抑制剂对照，即可在蛋白水平严谨判断通路是否激活。
1.cGAS（胞质DNA感受器）：约60 kDa，位于胞质的单条主带。通路被激活后，其表达量可轻微上调，但更重要的是它必须与DNA结合并催化下一步反应，因此WB中常关注其总蛋白表达是否足够，而非磷酸化。
2.STING 总蛋白：约42 kDa的单体条带；在非还原胶中可见70–90 kDa的寡聚体（二聚体或高阶寡聚体）。单体总量一般不变，寡聚体出现即提示STING已发生构象变化并进入激活状态。
3.p-STING (Ser366)：与总STING同一条带，但因磷酸化导致迁移略慢或条带强度明显增强。该条带的出现是STING被cGAMP激活的直接证据。
4.TBK1总蛋白：约84 kDa的单条带，总量稳定，仅作为上样对照和定位参考。
5.p-TBK1 (Ser172)：同样位于84 kDa，但磷酸化后条带信号显著增强。≥2倍强度提升表示TBK1已被STING信号体招募并自激活。 IRF3总蛋白： 约55 kDa的单条带，总量不变，用于确认IRF3表达充足。
6.p-IRF3 (Ser396)：55 kDa处条带增强或出现“超迁移”现象；在Native-PAGE中可见110 kDa二聚体条带。p-IRF3生成意味着TBK1已完成下游信号转导，即将启动I型干扰素基因转录。
结果解读：
激活：p-STING、p-TBK1、p-IRF3 三条磷酸化条带同步显著增强，同时非还原胶出现STING寡聚体。
阻断：上述磷酸化条带信号显著减弱或消失，提示通路被抑制。
验证案例
Li【1】等人研究cGAS-STING通路是否参与子宫内膜炎的发病机制中，验证外源性线粒体 DNA（mtDNA）是否能直接激活 cGAS-STING 通路。使用Invent 柱式法SD-001/SN-002 总蛋白提取试剂盒，从人子宫内膜基质细胞和小鼠子宫组织中提取总蛋白，WB检测 cGAS-STING 通路关键蛋白表达水平（cGAS、STING、TBK1、Pho-TBK1、IRF3、Pho-IRF3）。结果显示：mtDNA 组 vs 对照组相比，cGAS 表达上调、STING 表达升高、TBK1 和 IRF3 的磷酸化水平显著增加。说明外源性 mtDNA 能够模拟 LPS 的作用，直接激活 HESCs 中的 cGAS-STING 通路。
Fig2.The protein level of the cGAS-STING pathway by Western blot in indicated groups of HESCs.
图片来源：doi.org/10.2147/JIR.S374318
Liu【2】等人在研究非洲猪瘟病毒(ASFV)pB318L蛋白通过抑制 cGAS-STING 与 IFNAR-JAK-STAT 信号通路负向调控I型干扰素及干扰素刺激基因的表达实验中，为验证 ASFV 的 pB318L 蛋白是否影响STING从内质网向高尔基体的转位，使用Invent 柱式法GO-037高尔基体分离试剂盒成功从HEK293T细胞或猪肺泡巨噬细胞（PAMs）分离高尔基体组分，通过Western blot检测STING在高尔基体富集组分中的表达水平，结果表明在ASFV-WT（野生型）感染组中，STING在高尔基体上的定位显著减少；而在ASFV-intB318L（B318L缺失病毒）感染组中，STING在高尔基体上的定位明显增加。从而验证了 pB318L 蛋白影响STING从内质网向高尔基体的转位。
Fig3.PAMs were infected with ASFV-WT or ASFVintB318L(MOI = 1). At 24 hpi, the cells were collected and treated with Golgi Apparatus Enrichment reagent. The levels of STING on Golgi were detected by Western blotting (WCL refers to whole cell lysates)
图片来源：doi.org/10.1371/journal.ppat.1012136
参考文献
1.Li M, Wen X, Liu X, Wang Y, Yan L. LPS-Induced Activation of the cGAS-STING Pathway is Regulated by Mitochondrial Dysfunction and Mitochondrial DNA Leakage in Endometritis. J Inflamm Res. 2022;15:5707-5720 https://doi.org/10.2147/JIR.S374318
2.Liu, X., Chen, H., Ye, G., Liu, H., Feng, C., Chen, W., ... & Huang, L. (2024). African swine fever virus pB318L, a trans-geranylgeranyl-diphosphate synthase, negatively regulates cGAS-STING and IFNAR-JAK-STAT signaling pathways. PLoS pathogens, 20(4), e1012136.
3.Cui, S., Wang, Y., Chen, S., Fang, L., Jiang, Y., Pang, Z., ... & Jia, H. (2023). African swine fever virus E120R inhibited cGAS‐STING‐mediated IFN‐β and NF‐κB pathways. Animal Research and One Health.
4.Chen Wang; Xin Gao; Yanchen Li; Chenyang Li; Zhimin Ma; et al.(2024). A molecular subtyping associated with the cGAS-STING pathway provides novel perspectives on the treatment of ulcerative colitis. Scientific Reports.DOI 10.1038/s41598-024-63695-45.Kuo‐Wei Liao; Fengshuo Wang; C D Xia; Ze Xu; Sen Zhong; et al.(2024). The cGAS-STING pathway in COPD: targeting its role and therapeutic potential. Respiratory Research.DOI 10.1186/s12931-024-02915-x
6.Jia-min Du; Mei-jia Qian; Tao Yuan; Rui-han Chen; Qiao-jun He; et al.(2022).cGAS and cancer therapy: a double-edged sword.Acta pharmacologica Sinica.DOI 10.1038/s41401-021-00839-6
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