膜蛋白进行WB检测前，如何进行热变性是否让你困扰？检测膜蛋白是否可以与其他样品一样煮沸？还是根据部分抗体说明书70℃煮？还是不进行热变性？下面我们一起看文献案例对这个问题进行探究讨论并获得最终的答案吧！
Yoshiaki Tsuji【1】研究了跨膜铁转运蛋白WB前加热样本是否会对western blotting结果产生影响。 将25ug来自12个人细胞系RIPA缓冲液提取物与2X SDSPAGE样品缓冲液混合，在95˚C下加热5分钟或不加热（在室温下），并进行SLC11A2（二价金属转运体1,DMT1，Fig1.A)和SLC40A1(运铁素1,Fpn1，Fig1.B)蛋白质印迹。装载来自用pCMV、pCMV-DMT1或pCMV-Fpn1转染的HEK293细胞的10ug未加热的WCL作为对照。三角箭头指示为DMT1和Fpn1条带的位置。
Fig1.Comparison in DMT1 and Fpn1 western blotting between heated and unheated protein samples from 12 human cell lines.
在Fig1.A）中，长箭头表示DMT1蛋白粘附在分离凝胶的顶部。实验重复四次，显示了代表性的蛋白质印迹。实验结果发现只有在凝胶加载前未加热过的样品中才会出现DMT1蛋白的清晰条带，而加热样品(95℃，5min)， 则会引起DMT1蛋白聚集导致条带无法检出或位置错误。同样的，未加热的样品也可更好检测出Fpn1蛋白条带。
为了排除不同的裂解/样品加载缓冲液或提取方法对Fpn1检出的影响，又进行了如下实验。Fig2.A）RIPA缓冲液中的WCL由用pCMV或pCMV-Fpn1转染的HEK293细胞制备。将25ug WCL与2X SDSPAGE样品加载缓冲液混合，在95˚C下加热5min进行Fpn1蛋白质印迹。箭头表示粘附在分离凝胶顶部的Fpn1蛋白（也在B和C中）。Fig2.B） 用PCMV或PCMV-Fpn1转染HEK293细胞，分别在RIPA缓冲液中、RIPA加冰水三次超声10s中或在跨膜蛋白提取试剂中制备WCL。15ug的WCLS与2x SDSPAGE样品装载缓冲液混合，在95°C加热5min或不加热（室温），并进行FPN1蛋白印迹。箭头表示转染的FPN1条带Fig2.C） 将来自用pCMV或pCMV-Fpn1转染的HEK293细胞的RIPA裂解物分别与含有5%β-巯基乙醇（常规）、4M尿素或同时含有10%β-巯基乙醇和4M尿素的2X SDSPAGE样品加载缓冲液混合。一组样品在95˚C下加热5分钟，另一组样品不加热（在室温下），并进行Fpn1蛋白质印迹。实验重复三次，显示了代表性的蛋白质印迹。
Fig2. Comparison in Fpn1 (SLC40A1) western blotting between heated and unheated protein samples from Fpn1 transfected cells.
结果可见不同的裂解/样品加载缓冲液或超声均不能提高Fpn1蛋白印迹的分辨率。因此，加热样本对western blotting结果的影响十分严重，这表明其他成千上万的跨膜和热敏蛋白也存在类似的情况。
某老师在进行植物质膜蛋白WB 检测时，70 ℃ 热变性样品，植物质膜内参H+ATPase可以检测到，但目标蛋白却无法检测到，因此将样品做梯度温度热变性后进行检测，结果如图Fig3显示，目标蛋白在30-40℃间热变性检测效果最佳，随着热变性温度增高，条带减弱，至 70 ℃ 时则完全无法检测出。说明热变性温度对膜蛋白的检出具有严重的影响。
Fig3.热变性温度影响植物膜蛋白 WB 检测结果
从以上案例中我们可以发现，当煮沸或者高温加热变性样品时，膜蛋白检测或受到影响。产生这种现象可能的原因是，膜蛋白具有疏水性，当它们在高温下煮沸时，膜蛋白倾向于聚集并形成二聚体或多聚体，不能被抗体很好识别。此外，大的聚集体还可能直接沉淀，即使放入凝胶孔中，也可能滞留在胶孔中，从而导致随后的检测失败。因此，热变性温度对膜蛋白检测的影响是极大的，还有经验案例表明高温煮沸样品对糖基化蛋白检出的影响比非糖基化蛋白的影响更大。
膜蛋白应该如何热变性？
根据案例分析，如果样品是膜蛋白或热敏感蛋白，例如细胞质膜、线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体以及内体等样品，加 入Loading buffer 后，建议热变性处理步骤采用37℃，孵育30分钟，或者根据样品本身情况，采用梯度温度热变性检测最佳温度后，谨慎调整热变性温度，以提高检测效率。
美国 INVENT 公司专注于蛋白样品制备十余年，深挖开创一系列柱式法快速蛋白提取和亚细胞结构分离工具，利用柱式法可在1分钟获得细胞样品变性总蛋白，获得真正意义上内源基线无改变的总蛋白【2】。更可通过柱式法分离各类亚细胞结构，如细胞核内部的核基质【3】，核膜【4】，完整的细胞核【5】，细胞膜【6】，内质网【7】，高尔基体【8】，溶酶体【7】，内体【7】，蛋白酶体，线粒体【9】，细胞浆等，适用于各类下游实验，助力您完成蛋白功能机理的研究。
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参考文献：
【1】.Tsuji Y (2020) Transmembrane protein western blotting: Impact of sample preparation on detection of SLC11A2 (DMT1) and SLC40A1 (ferroportin). PLoS ONE 15(7): e0235563. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235563
【2】.Li. Q. (2016) Pitfalls of protein extraction by RIPA buffer. BioTechniques, Vol. 61, No. 6, December 2016, p. 327.
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【4】.Zervopoulos, S. D., Boukouris, A. E., Saleme, B., Haromy, A., Tejay, S., Sutendra, G., & Michelakis, E. D. (2022). MFN2-driven mitochondria-to-nucleus tethering allows a non-canonical nuclear entry pathway of the mitochondrial pyruvate dehydrogenase complex. Molecular Cell, 82(5), 1066-1077
【5】.Yang, N., Occean, J. R., Melters, D. P., Shi, C., Wang, L., Stransky, S., ... & Sen, P. (2023). A hyper-quiescent chromatin state formed during aging is reversed by regeneration. bioRxiv, 2023-02.
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