Western Blot（WB）作为蛋白质检测的关键技术，因其步骤繁琐，易受多种因素干扰，即使使用同次提取的蛋白样品，重复实验结果也可能存在差异。哪些环节会造成这些差异，又该如何避免？以下将深入剖析各环节的影响因素及优化策略，助力您提升WB实验的稳定性和重复性。

（一）样品裂解与蛋白提取

裂解液的成分如pH 值、盐浓度、去污剂种类和浓度等对蛋白的提取效率和稳定性起着决定性作用。不合理的裂解液的配方可能导致裂解效率差，裂解不充分，延长孵育时间，增加蛋白降解的风险。或者裂解液的使用量不足，可能会导致蛋白提取不完全或部分蛋白降解。进而影响 WB 结果，出现条带强度低、模糊或非特异性条带等问题。

使用高效率的蛋白提取方法，严格按照标准操作规程（SOP）配制和使用裂解液，并根据样品类型和量优化使用量，确保充分裂解细胞或组织。推荐使用Invent柱式法快速蛋白提取试剂盒，如 SD-001/SN-002 动物细胞 / 组织总蛋白提取试剂盒，其高效裂解能力可在 1 分钟内获得变性总蛋白，显著缩短样品裂解时间，降低蛋白降解风险。并同时去除核酸及碎片干扰，不产生不可溶组分，可有效提高蛋白质的提取效率及蛋白质量，更利于获取稳定的实验结果。

（二）蛋白酶和磷酸酶抑制剂的使用

在蛋白提取过程中，蛋白酶和磷酸酶的激活会引发蛋白降解或去磷酸化，破坏蛋白的完整性和功能，进而影响抗体识别效率，导致信号异常减弱或非特异性条带的出现。

在裂解液中加入适量的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂。并确保在样品裂解前立即加入，同时加快样品处理速度，以减少蛋白降解的可能性。

（三）样品均匀性

蛋白提取后的各操作步骤，如裂解、离心后重悬等，若未充分混匀，会导致蛋白在不同重复样品中分布不均。例如，细胞裂解后未充分涡旋混匀，部分蛋白可能沉淀于管底，而另一些则悬浮于上清，致使取样时实际蛋白含量存在差异。

在蛋白提取后的每一步操作，如裂解、离心后重悬等步骤，都要确保充分混匀，可以采用涡旋、上下颠倒混匀等方式。

（一）蛋白浓度测定的准确性

常用的蛋白浓度测定方法（如 Bradford 法、BCA法）存在一定误差范围。如果标准曲线的制作不准确（例如，标准品的稀释不准确或比色杯中有气泡），或者样品没有充分混匀，可能会导致测得的蛋白浓度不准确。导致重复实验时加载到凝胶中的蛋白量不一致，影响电泳和显色结果稳定性。例如，加载的蛋白量过多可能导致条带过强或弥散，而加载量过少可能导致条带过弱或无法检测到目标蛋白。

- 制作标准曲线时，确保标准品的稀释准确，并使用高质量的比色杯和分光光度计。

- 在测定蛋白浓度前，确保样品充分混匀。

- 对于高浓度样品，可以进行适当稀释后再测定浓度，以确保测定结果在标准曲线的线性范围内。

（一）样品制样和混匀

蛋白样品的制样过程中，加热和混匀是关键步骤。加热时间或温度不正确，或未充分混匀，可能会导致蛋白变性不完全或沉淀。这可能会使条带迁移速度异常，出现非特异性条带或条带模糊，或部分蛋白无法进入凝胶，从而影响条带强度。

- 在加载样品前，确保样品在 95°C 下加热 5-10 分钟，以充分变性蛋白。膜蛋白建议37℃孵育30分钟。

- 加热后，立即涡旋混匀样品，确保蛋白均匀分布。

（二）样品的保存

蛋白样品在保存过程中可能会发生一系列变化：

1.物理变化

1）聚集

蛋白质分子在冷冻状态下，由于冰晶的形成，使得溶液中的蛋白质浓度相对升高。当蛋白质分子之间的距离变近时，分子间的疏水相互作用、静电相互作用等会增强，从而导致蛋白质聚集。

2）沉淀

冷冻过程中，随着温度的降低，蛋白质溶液的溶解度会发生变化。一些蛋白质可能会因为溶解度降低而从溶液中沉淀出来。

3）相分离

冷冻时，蛋白质溶液体系的相态可能会发生改变。由于冰晶的生成改变了溶液的组成和性质，可能会导致蛋白质与溶剂之间出现相分离现象。

2.化学变化

1）氧化

在冷冻环境下，虽然化学反应速率通常会降低，但蛋白质仍然可能会发生氧化反应。空气中的氧气或者溶液中残留的氧化剂可以与蛋白质分子中的氨基酸残基（如色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等）发生反应。

蛋白质氧化后，其结构和功能会发生改变。例如，半胱氨酸残基被氧化会导致二硫键的形成或破坏，从而改变蛋白质的构象，影响其生物活性。

2）脱酰胺化

蛋白质中的天冬酰胺和谷氨酰胺残基在冷冻条件下可能发生脱酰胺化反应。这种反应会使蛋白质的电荷分布发生改变，进而影响其与其他分子的相互作用以及自身的稳定性。

3）二硫键的破坏或形成

冷冻过程中，蛋白质分子的热运动减小，但分子内部和分子间的化学键仍然可能会发生变化。一些蛋白质的二硫键可能会被破坏，同时在新的条件下也可能会形成新的二硫键。

综上，蛋白样品保存期间可能经历物理变化（如聚集、沉淀、相分离）和化学变化（如氧化、脱酰胺化、二硫键的破坏或形成），导致蛋白降解或变性，进而影响 WB 结果稳定性。

建议提取后立即实验，避免长期保存；如需保存，分装成小份于 - 80°C 保存，减少反复冻融，并在使用前充分解冻混匀。

（一）凝胶制备差异

不同批次凝胶在制备过程中，其浓度、交联程度可能会有细微差异，如丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合比例不准确、聚合时间不同，会影响凝胶孔径大小和均匀性，导致蛋白迁移速度不同，重复实验中条带位置或强度出现差异。

精确配制凝胶溶液，采用标准化操作流程制备凝胶，尽量使用同一批次试剂，或选择预制胶。

（二）样品加载与电泳条件

1.样品加载：加载样品时，不同孔中蛋白量不一致或样品未均匀分布，会导致电泳结果不一致，影响 WB 结果可比性。

需使用移液器准确加载样品，确保每个孔中蛋白量一致；加载前充分混匀样品，防止蛋白沉淀或分层。

2.电泳条件：电泳的电压、时间和温度等条件对蛋白迁移速度影响显著，条件不一致会导致条带位置和强度差异。

应使用稳定电泳设备，保证电泳条件一致性，同时在电泳装置附近放置温度计监控温度变化，保持温度恒定。

（一）转膜效率差异

转膜缓冲液成分、转膜时间和电压等条件会影响蛋白从凝胶转移到膜上的效率。转膜缓冲液中甲醇浓度过高或过低会改变膜对蛋白的结合能力；转膜时间过短或过长会使蛋白转移不完全或过度扩散。

优化转膜条件，根据蛋白大小和性质选择合适的缓冲液和时间，确保转膜装置密封性良好，避免气泡阻碍蛋白转移。并保持每次实验条件的统一。

（二）膜的选择与处理

不同批次的 PVDF 或硝酸纤维素膜在孔径大小、结合蛋白能力等性能上存在细微差异，这会导致转膜后蛋白固定情况不同，进而影响后续抗体孵育和显色结果。

应尽量使用同一批次的膜，并按说明书要求进行活化（如 PVDF 膜用甲醇活化），转膜后通过染色（如 Ponceau S 染色）检查蛋白转移情况。

（一）抗体质量

不同批次抗体的特异性和亲和力可能不同，同一批次抗体若保存不当，如反复冻融、长时间暴露在高温或强光下，活性会下降，导致抗体与目标蛋白结合效率不同，出现显色强度差异。

选择质量可靠的抗体供应商，按保存要求保存抗体，避免反复冻融，分装保存，使用前在冰上融化。

（二）孵育条件

抗体孵育的时间、温度和摇床转速等条件会影响抗体与蛋白的结合。孵育时间过短、温度异常会影响抗体活性和结合效率，孵育过程中抗体未充分混匀会导致分布不均。

严格按照抗体说明书推荐的孵育条件进行操作，确保孵育时间和温度的一致性。定期轻轻摇动或颠倒混匀，使抗体与膜充分接触。

（三）显色试剂

显色试剂（如 ECL 试剂）的质量和新鲜程度对显色结果影响重大。过期或保存不当的显色试剂发光强度会下降，显色时间过短或过长也会导致信号异常。另外显色信号的强度与加载的蛋白量成正比。如果加载量不一致，显色信号的强度也会不一致。

保持重复实验中样品加载量一致，并使用新鲜的显色试剂，按说明书操作，密切观察显色情况，及时停止显色，避免信号过强或过弱。

Western Blot 实验中每个环节都至关重要，任何细微误差都可能影响实验结果的稳定性和重复性。为确保 WB 结果的可靠性，建议在实验过程中：

1. 严格遵循标准操作规程（SOP），确保每一步操作的一致性。

2. 使用高质量的试剂和耗材，尽量使用同一批次的裂解液、抑制剂和显色试剂。

3. 在样品处理和保存过程中，注意避免蛋白降解和变性。

4. 确保电泳和转膜条件一致性，避免因实验条件的差异导致结果不稳定。

通过优化这些步骤，可以显著提高 Western Blot 实验的稳定性和重复性，为获得更可靠的实验结果奠定坚实基础。