WB样品制备大揭秘，不同裂解液，不同方法结果报告出炉！
栏目：技术    日期：2020-06-17    来源：admin
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上周关于WB样品制备大揭秘的直播大家看的可还过瘾？还没过瘾点这里回看。没有时间回看的小伙伴也不要着急，贴心的为你准备了这份最终结果报告。WB样品制备到底有哪些你不知道的事？快来看谜底！


1
不同裂解液配方对相同样品的提取


使用样品：

脑组织分离的单细胞（单细胞分离试剂盒Cat#CS-031）


裂解液：

RIPA强/ RIPA /RIPA弱/SD-001 四种


操作方法：

20ul脑细胞分别加入200ul不同裂解液，孵育15分钟，离心10分钟


实验结果：



图中可见，RIPA强，RIPA，RIPA弱三管提取物管底均有明显的白色沉淀团(RIPA不可溶组分），对应裂解液强度不同，RIPA弱沉淀团最大，其次为RIPA，再次为RIPA强，SD-001提取物管底无肉眼可见沉淀。


 

RIPA提取物产生的不可溶组分，再次加入SD-001溶解液裂解后，离心5分钟，RIPA不可溶组分彻底溶解，无沉淀。


RIPA不可溶组分的进一步研究：

使用RIPA和柱式法SD-001提取小鼠脾脏及肝脏总蛋白，第1道柱式法SD-001,第2道RIPA可溶组分，第3道RIPA不可溶组分再次使用SD-001提取后，进行SDS-PAGE，考染检测结果如下。

Li Q,(2016). Pitfalls of Protein Extraction by RIPA Buffer. BioTechniques 61:327 .doi 10.2144/000114486

经过进一步对沉淀团的研究我们得到了如下结论：

  1. RIPA不可溶组分中（3道）含有蛋白

  2. 所含蛋白具有随机性，不可控性

  3. RIPA不可溶组分与可溶组分的蛋白谱有显著差异（非等比）


实验结论：

不同裂解液配方对蛋白的溶出效率有所不同，溶出效率越差，蛋白损失越多，不同的裂解液提取到的蛋白谱有差异，最终对下游实验会产生影响。（细胞凋亡，磷酸化检测，激酶活性检测，细胞外基质，WB内参不齐，LC3指标不出等等）


扫码查看案例解析RIPA提蛋白对下游实验有哪些影响

 


2
不同提取方法对相同样品的提取


使用样品：

肾脏组织，脑组织


提取方法：

溶液法（RIPA强）VS 柱式法（SD-001裂解液+离心管柱）


操作方法：

溶液法：15mg组织+150ulRIPA，研磨孵育15分钟，离心10分钟

柱式法：15mg+150ulSD-001裂解液，柱上研磨，离心30秒


实验结果：

溶液法：提取后有较多的不可溶组分，特别是脑组织样品，难以吸取

柱式法：无明显不可溶组分

BCA检测结果：

 

得率计算：


肾脏

（RIPA）

肾脏

（柱式法）

脑

（RIPA）

脑

（柱式法）

体积 100ul 130ul 75ul 130ul
浓度 低 高 低 高
得率 低 高 低 高


实验结论：

不同的提取方法所得到的蛋白质量（得率，杂质，蛋白谱）有明显的差异，得率低，杂质多，蛋白谱差异都会影响下游实验，出现结果异常。


PS：

BCA检测时，标曲对照一定要加入裂解液进行检测，以免出现偏差。（我们发现有裂解液加入BCA工作液就变色的情况哦~）



总结：

WB样品制备的关键：

  1. 获取最大的蛋白质溶解度，减少蛋白质损失以及尽量去除杂质。

  2. 获取给定样品中完整的蛋白质图谱，要真实的反映所有蛋白质种类和比例。获得真实意义上的总蛋白，并非RIPA可溶性组分。


柱式法蛋白提取

MinuteTM 动物细胞/组织样品总蛋白提取

SD-001/SN-002


  1. 优化的裂解液配方有效解决蛋白溶解度差，丢失蛋白问题，得率更高。

  2. 含变性、天然两款裂解液，应对不同下游实验。

  3. 离心管柱技术，有效去除粘稠物杂质等，让蛋白样品更干净。

  4. 1分钟一管式操作获取真正意义上的总蛋白谱，让蛋白实验赢在起跑线！








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