原代细胞因其具有与体内细胞高度相似的生理特性和功能特点，在疾病机制研究、药物研发等诸多研究中发挥着不可替代的作用，但同时也因其特性而使得蛋白样品制备面临诸多困难。

一、细胞数量有限

• 原代细胞通常取自于生物体组织，其生长特性与体内环境紧密相关，来源相对有限，每一次获取都较为珍贵。与细胞系等其他细胞来源相比，原代细胞对环境条件更为敏感，包括温度、酸碱度、渗透压等微小的变化都可能影响细胞状态，增殖能力有限。例如，成纤维原代细胞在体外培养时，通常只能传代2-3代，细胞数量难以像细胞系那样通过不断传代大量扩增。这导致用于提取蛋白的细胞材料相对较少，进而使得蛋白提取的总量受到限制。

二、细胞脆弱易受损

• 原代细胞对培养环境要求极为苛刻。它们对温度、pH值、渗透压等条件变化敏感。在进行蛋白提取操作过程中，例如洗涤细胞步骤，若离心力过大，可能会导致细胞膜破裂，使细胞内容物泄漏，影响后续蛋白提取的纯度和活性；而离心力过小，则无法有效收集细胞，造成细胞损失。

• 原代细胞的细胞膜较为脆弱。在使用裂解液进行细胞裂解时，裂解条件的控制非常关键。如果裂解液的成分、浓度或作用时间不合适，很容易导致细胞部分裂解不完全，使蛋白释放不充分，或者过度裂解，造成细胞碎片过多，干扰蛋白的提取和纯化过程。

三、蛋白种类复杂且含量差异大

• 原代细胞包含丰富的蛋白种类。不同类型的原代细胞，如肝细胞、神经细胞等，其蛋白组成各有特点。例如，肝细胞富含与代谢相关的蛋白质，像细胞色素 P450 酶系等；神经细胞则含有大量与神经信号传导相关的蛋白，如离子通道蛋白等。这些蛋白在细胞内的含量差异巨大，从高丰度的结构蛋白到低丰度的信号分子。

• 在提取蛋白时，高丰度蛋白可能会掩盖低丰度蛋白，使得低丰度蛋白的提取和检测变得困难。而且，由于原代细胞功能的多样性和复杂性，这些蛋白之间可能存在相互作用，一些蛋白可能以复合物的形式存在。在提取过程中，如何保持蛋白复合物的完整性也是一大挑战。

四、易受内源性和外源性因素干扰

• 内源性因素方面，原代细胞自身含有丰富的蛋白酶和磷酸酶。在细胞裂解后，这些酶可能会对目标蛋白产生降解或去磷酸化等修饰作用。例如，蛋白酶会水解蛋白质的肽键，导致蛋白片段化，改变蛋白的结构和功能；磷酸酶则会去除蛋白上的磷酸基团，影响蛋白的活性状态和后续的分析。

• 外源性因素主要是指在提取过程中可能引入的杂质。例如，在使用组织培养皿培养原代细胞时，培养皿中的微量杂质或残留的培养基成分可能会混入蛋白提取物中。另外，使用的试剂纯度不高也会影响提取蛋白的质量，像裂解液中的杂质可能会与蛋白发生非特异性结合，或者在后续的纯化步骤中产生干扰。

五、提取过程对细胞功能状态的依赖性

• 原代细胞的蛋白表达和状态与细胞所处的生理功能状态密切相关。只有处于健康、正常生理功能状态的原代细胞才能提取到具有正常活性和功能的蛋白。如果原代细胞在培养过程中受到应激刺激（如缺氧、氧化应激等），其内部的蛋白合成和代谢过程会发生改变。例如，在缺氧环境下，原代细胞中的某些蛋白的表达量可能会下降，或者发生错误折叠，这会直接影响蛋白提取后的质量和可用性。

针对原代细胞蛋白样品制备的诸多难点， Invent 柱式法总蛋白提取试剂盒可以更好的应对以上问题，采用特殊的离心管柱技术和特制优化的裂解液，整个操作流程简便且高效。

一、超小裂解体系：

• 仅需3ul细胞，加20ul裂解液，即可进行蛋白样品的制备。

二、特制裂解液：

• 试剂盒同时配有变性裂解液和天然裂解液，可满足不同下游实验。变性裂解液可以进行WB，SDS-PAGE，质谱等实验，天然裂解液可以进ELISA，IP，Co-IP，酶活性检测等实验。

三、有效去除杂质：

• 使用离心管柱技术能够有效去除杂质，包括细胞碎片、核酸等成分，从而获得较高纯度的总蛋白，减少了后续实验中杂质对结果的干扰，提高了实验的准确性和可靠性。

四、高质量，高得率：

• 裂解液可有效充分裂解原代细胞，不产生不可溶性蛋白，得率高无蛋白丢失，可从珍贵的原代细胞中获取更多的研究材料。

五、一管式操作：

• 裂解，离心过柱，一管操作即可获得高质量蛋白质，无需转移操作，减少蛋白损失。整个流程步骤清晰，操作时间相对较短，对于实验人员的技术要求相对宽松，降低了因操作不当导致的实验失败风险。

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一、保持低温环境：

• 在低温环境下，细胞内酶的活性会受到抑制，这样可以减少蛋白的降解。整个提取过程最好在冰上或者 4℃的环境中进行。使用的试剂、工具等都提前预冷。比如离心管、移液器枪头等，可以提前放在冰箱的 4℃环境中预冷 10-15 分钟左右。

二、选择合适的裂解液：

• 不同的蛋白在细胞内的存在状态不同，有的蛋白和细胞膜紧密结合，有的则在细胞质中相对容易释放。不同的裂解液成分和浓度对不同类型蛋白的提取效率差异很大。如果裂解液不适合，可能会导致一些蛋白无法充分释放，或者过度裂解使蛋白变性失活。根据原代细胞的类型以及下游实验来选择裂解液。

三、避免蛋白降解：

• 除了细胞内的蛋白酶会对提取的蛋白造成降解，提取过程中的一些操作也可能引入蛋白降解的因素。例如，在反复冻融的过程中，细胞内的冰晶形成和融化都可能破坏蛋白的结构，使其被蛋白酶作用而降解。在提取过程中尽量快速完成操作，避免样品及蛋白的反复冻融。如果需要保存提取的蛋白，可以将蛋白溶液分成小份，每份根据后续一次实验的用量来分装，然后在 - 80℃下保存。同时，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂，如 PMSF，抑制蛋白酶的活性，减少蛋白降解。

四、防止蛋白氧化：

• 一些蛋白含有容易被氧化的基团，如半胱氨酸残基上的巯基。在提取过程中，如果暴露在氧气环境中，这些基团可能会被氧化，导致蛋白的结构和功能发生改变。可以在裂解液中添加一些抗氧化剂，如β - 巯基乙醇或者二硫苏糖醇。这些抗氧化剂能够还原被氧化的巯基，保持蛋白的还原状态。同时，在操作过程中尽量减少蛋白溶液与空气的接触时间，避免剧烈摇晃等操作，降低蛋白被氧化的风险。

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