样品破碎方法——你选对了吗?
栏目:技术    日期:2021-08-04    来源:admin

蛋白质是细胞、组织、器官的重要组成成分,蛋白质作为生物大分子能触发和介导众多信号通路以执行机体功能,对蛋白质的研究可以揭示机体功能信息,疾病途径以及基因表达特征。




当研究蛋白质时首要的挑战便是如何从样品中获取蛋白质,而蛋白质提取过程势必会涉及到细胞破碎——即破坏细胞壁和/或细胞膜,使胞内产物获得更大程度的释放,再通过不同的离心力及时间将处于细胞不同位置的蛋白释放出来,溶入已知成分的溶液内。该步骤是蛋白质初级分离纯化阶段的重要环节,它直接影响产物的回收率,也可能影响产物的纯度。




细胞破碎按照是否存在外加作用力基本可分为两大类:机械法和非机械法。

机械法包括匀浆、研磨、超声等;

非机械法包括反复冻融、化学、酶解等。


机械法


  • 匀浆器(玻璃、硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂)



先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离,此法适用于小样本量动物脏器组织。
存在的问题:韧性组织如心肌、韧带、肌腱等易造成堵塞,质地坚硬样品如骨骼等易损伤匀浆阀。


  • 研磨法、珠磨法



研磨法原理:借助研磨中磨料(常用磨料为石英砂、氧化铝)和细胞间的剪切及碰撞作用破碎细胞。

该法主要用于植物组织和细菌的细胞破碎,部分动物组织也适用,研磨时需加少量液氮以保证低温状态防止蛋白降解,操作务必小心谨慎。

珠磨法属于研磨法的扩展,利用研磨珠与细胞悬浮液一起快速搅拌,由于研磨作用,使细胞获得破碎,珠磨破碎过程中会产生大量的热能,在设计操作时应充分考虑换热能力,此法适用于小样本量的组织样品。


  • 超声波法



原理:强声波作用溶液时,气泡产生、长大、破碎和空化现象引起冲击波和剪切力使细胞裂解,超声波的破碎效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度和细胞类型等。

超声破碎常用于脑组织匀浆和细胞破碎,在操作过程中会产生大量的热,因此需在冰水或有外部冷却的容器中进行,但是空化作用产生的活性氧自由基会使某些敏感性活性物质变性失活,同时超声产生的泡沫使蛋白与空气接触增多可能会导致部分蛋白的降解(一些蛋白的泛素化依赖于氧化,如HIF-1α)。


非机械法


  • 反复冻融法



将细胞在-20度以下冰冻,室温融化,反复几次,由于细胞内冰晶形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。

此法多适用于动物组织、细胞样品,但IP/Co-IP实验需谨慎使用,因为反复冻融会严重破坏蛋白的空间结构和结合蛋白。


  • 化学法



化学法是一类采用化学处理来溶解或提取细胞内组分的方法,常用的化学试剂有酸、碱、表面活性剂以及有机溶剂等。碱/表面活性剂能溶解细胞壁/细胞膜上的脂类物质,或使某些成分从细胞内渗透出来;有机溶剂一般使用脂溶性溶剂,能溶解细胞壁/细胞膜上的磷脂层,使细胞结构破坏,从而使胞内物质释放出来

化学法容易引起蛋白质失活,同时化学试剂的加入可能会影响下游应用,某些应用可能需要将化学试剂完全去除,比如蛋白质组学在质谱前需要去除SDS。



综上所述,无论是机械法还是非机械法,每种方法都有各自的局限性,实验室虽通过多种破碎方法相结合以获取更多的蛋白质,但也避免不了蛋白质降解、蛋白丢失、蛋白失活、核酸干扰等问题。



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(2)特殊裂解液配方:有效溶解蛋白质包括难溶性蛋白,无蛋白丢失;

(3)天然蛋白裂解液/变性裂解液:按照实验需求选择裂解液以选择是否保留蛋白高级结构。

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