当我们需要证明细胞内蛋白间的相互作用时，IP/Co-IP几乎是必做项目，IP/Co-IP实验简而言之，就是一场追捕游戏，抗体捕获抗原，磁珠捕获抗体-抗原复合物。

IP是利用固定在磁珠或者琼脂糖树脂等固相支持物上特异性抗体对抗原进行亲和纯化的一种方法，简而言之就是利用抗原-抗体特异性反应纯化富集目标蛋白。

特定蛋白的抗体（单克隆或多克隆）固定在不溶性支持物（如琼脂糖树脂或磁珠）上，随后与含有目标蛋白的细胞裂解物一起孵育。在孵育期间，轻轻搅动裂解物使目标抗原结合到固定抗体上，形成抗原-抗体免疫复合物。最后将免疫复合物从固相支持物上洗脱，进行目标抗原的性质分析。

Co-IP是以抗原与抗体之间的专一性为基础，用于研究蛋白—蛋白相互作用，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀蛋白质X，那么与蛋白质X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

总而言之，IP与Co-IP之间的区别在于：

IP是通过对某蛋白质的富集，研究该蛋白的特性；

Co-IP是通过对某蛋白的富集，研究与其结合的其它蛋白在体内的相互作用，但无法确定是直接相互作用还是间接相互作用。

免疫沉淀的成功依赖于抗原的纯度和丰度，以及抗体对抗原的亲和力。蛋白样品的质量决定了抗原-抗体反应中抗原的质量、浓度以及抗原是否维持天然构象状态，是否保留了蛋白质和蛋白质间的相互作用，所以样品制备是免疫沉淀实验成功的基础。

IP/Co-IP裂解缓冲液很大程度上会影响蛋白样品质量，理想的裂解液应具有以下特点：

1)获得维持天然构象的蛋白质

2)最大限度避免结合位点变性

3)从细胞或组织中最大限度获取蛋白质

样品制备方案——IP/Co-IP裂解缓冲液应能从样品中获得足量的蛋白质并维持蛋白质的天然构象：

1)使用非离子型去污剂配制裂解缓冲液

含有非离子型去污剂（例如NP-40、Triton X-100），有助于维持蛋白质的天然构象

2)使用自配裂解液

当上述裂解液裂解效果不佳时，可以采用比较温和的裂解缓冲液体系，加入适量的离子型去污剂增加裂解效力，优化方案如下表（仅供参考），但同时需要注意离子型去污剂可能会破坏蛋白质的天然构象，破坏蛋白间的相互作用

优化方案-IP/Co-IP裂解液缓冲液成分浓度范围

3）推荐使用：

柱式法IP/Co-IP蛋白样品制备试剂盒

柱式法总蛋白提取试剂盒专为IP/Co-IP实验优化了天然裂解液配方，在保证蛋白天然构象的同时，可有效溶出较难溶解的蛋白（包括膜蛋白，核蛋白，细胞器蛋白）（蛋白得率通常是传统方法的1-2倍——客户反馈），配合离心柱技术可快速去除核酸干扰。无需反复摸索裂解液配方，适用于大部分样品IP/Co-IP实验的蛋白制备。

注：大多数免疫沉淀实验需在4℃下进行，同时依据实验目的提前将蛋白酶抑制剂和或磷酸酶抑制剂添加到裂解液中。

IP/Co-IP实验的成功与否与蛋白样品质量（抗原质量）息息相关，选择合适的蛋白制备方案，提高蛋白样品质量是实验的成功必要条件。在下一讲解中，我们将针对IP/Co-IP实验的各种疑难杂症进行讨论，扫描下方二维码持续关注！