细胞裂解样本中包含蛋白质，脂质，碳水化合物和核酸等。实验所用的捕获抗体或微珠（琼脂糖树脂或磁珠）可能会非特异性结合除靶蛋白之外的其它分子，从而导致假阳性结果和免疫印迹上的杂乱背景。对裂解样本进行预处理操作，是去除非特异性结合物最为简单有效的方法：

（1）当进行预先固定特定抗体免疫沉淀时，将裂解样本与微珠单独混合孵育，随后去除微珠并收集上清液，再进行免疫沉淀实验。

（2）当进行游离抗体免疫沉淀时，使用同型对照抗体（即没有特异靶标的一抗，但在类别和亚型上，其跟实验应用中的靶标一抗一致），在相同的组分条件中与裂解样本混合孵育，再进行免疫沉淀实验。

在Co-IP实验中，建议进行预清洗——有助于去除在免疫沉淀过程中可能与捕获抗体和微珠非特异性结合的分子，从而减少非特异性结合并改善图像信噪比。

免疫沉淀中捕获抗体和蛋白质之间的结合的目标是建立稳定的抗体-蛋白质复合物：

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（1）多克隆抗体与靶蛋白有多个表位结合位点，因此与单克隆抗体相比，多克隆抗体与靶蛋白之间形成更紧密的抗体-蛋白复合物（多克隆抗体与靶蛋白之间的高保留率也意味着在洗涤步骤中，靶蛋白不太可能被洗掉）。

（2）单克隆抗体识别靶蛋白上的单个表位结合位点，不太适合快速捕获靶蛋白。但单克隆抗体对其靶蛋白具有很高的特异性，因而实验结果背景较低，可作为免疫沉淀的良好检测抗体。

Protein A和Protein G缀合的微珠是捕获免疫沉淀中抗体-蛋白质复合物的常见系统。Protein A和Protein G对抗体都有很高的亲和力。

抗体结合蛋白应根据所用的捕获抗体来确定：

（1）Protein A——只与Fc区域结合

（2）Protein G——结合Fc区域和部分轻链

（3）Protein A/G——重组蛋白，兼具Protein A和Protein G的结合位点

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Protein A和Protein G 对于不同物种和不同亚型的抗体结合能力差异如下表所示，Protein A对兔来源抗体的亲和力较高，Protein G对于小鼠等部分哺乳动物抗体的亲和力较高。