搞定IP/Co-IP实验,看了就懂了!
栏目:技术    日期:2021-08-04    来源:admin

在上一期我们主要解析了IP/Co-IP的基本原理以及蛋白样本制备对IP/Co-IP实验的重要性,在本期中,我们将深入探讨影响免疫沉淀实验结果的潜在因素。

首先我们简单回顾一下免疫沉淀的实验流程,免疫沉淀实验通常分为两种方式:预先固定特定抗体和游离抗体

(1)预先固定特定抗体的免疫沉淀

特定蛋白的抗体(单克隆或多克隆)固定在固相支持物(如琼脂糖树脂或磁珠)上,随后与含有靶蛋白的细胞裂解物一起孵育。在孵育期间,轻轻搅动裂解物使目标抗原结合到固定抗体上,形成抗原-抗体免疫复合物。随后,将免疫复合物从固相支持物上洗脱,进行目标抗原的性质分析。

(2)游离抗体的免疫沉淀

游离的抗体加入裂解物中形成免疫复合物,然后利用固相支持物回收抗原-抗体免疫复合物。随后,将免疫复合物从固相支持物上洗脱,进行目标抗原的性质分析。

当靶蛋白丰度较低、抗体与抗原的亲和力较弱,则使用游离抗体形成免疫复合物的方法更好

影响IP/Co-IP实验的潜在因素


细胞裂解样本的制备

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细胞裂解样本制备是免疫沉淀实验的第一步,拥有合适的裂解缓冲液对制备高质量的免疫沉淀样品至关重要。

关键点——IP/Co-IP裂解液应能从样品中获得足量的蛋白质并维持蛋白质的天然构象,具体方案请回看上一期《IP/Co-IP——一场追捕游戏!》

谨请注意:对于Co-IP,由于某些蛋白质在反复冻融中会丧失其天然结构,破坏蛋白质-蛋白质间的相互作用,因此建议在进行Co-IP时使用新鲜的裂解液样本。

细胞裂解样本预清洗

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细胞裂解样本中包含蛋白质,脂质,碳水化合物和核酸等实验所用的捕获抗体或微珠(琼脂糖树脂或磁珠)可能会非特异性结合除靶蛋白之外的其它分子,从而导致假阳性结果和免疫印迹上的杂乱背景。对裂解样本进行预处理操作,是去除非特异性结合物最为简单有效的方法:

(1)当进行预先固定特定抗体免疫沉淀时,将裂解样本与微珠单独混合孵育,随后去除微珠并收集上清液,再进行免疫沉淀实验。

(2)当进行游离抗体免疫沉淀时,使用同型对照抗体(即没有特异靶标的一抗,但在类别和亚型上,其跟实验应用中的靶标一抗一致),在相同的组分条件中与裂解样本混合孵育,再进行免疫沉淀实验。

在Co-IP实验中,建议进行预清洗——有助于去除在免疫沉淀过程中可能与捕获抗体和微珠非特异性结合的分子,从而减少非特异性结合并改善图像信噪比。

抗体选择

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免疫沉淀中捕获抗体和蛋白质之间的结合的目标是建立稳定的抗体-蛋白质复合物

图片来源:biotechniques

(1)多克隆抗体与靶蛋白有多个表位结合位点,因此与单克隆抗体相比,多克隆抗体与靶蛋白之间形成更紧密的抗体-蛋白复合物(多克隆抗体与靶蛋白之间的高保留率也意味着在洗涤步骤中,靶蛋白不太可能被洗掉)。

(2)单克隆抗体识别靶蛋白上的单个表位结合位点,不太适合快速捕获靶蛋白。但单克隆抗体对其靶蛋白具有很高的特异性,因而实验结果背景较低,可作为免疫沉淀的良好检测抗体。

建议使用多克隆抗体用于捕获抗原,结合使用单克隆抗体用于检测——可以提高捕获效率和提升检测特异性

选择抗体结合蛋白

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Protein A和Protein G缀合的微珠是捕获免疫沉淀中抗体-蛋白质复合物的常见系统。Protein A和Protein G对抗体都有很高的亲和力。

抗体结合蛋白应根据所用的捕获抗体来确定:

(1)Protein A——只与Fc区域结合

(2)Protein G——结合Fc区域和部分轻链

(3)Protein A/G——重组蛋白,兼具Protein A和Protein G的结合位点