看了这些应用案例，植物膜蛋白提取方法我“get”了！
栏目：技术    日期：2023-08-04    来源：admin

质膜（plasma membrane，细胞膜）是植物细胞中重要的细胞器，负责调节细胞质和细胞外环境之间的分子交换，是了解植物生长发育的分子机制的重要研究对象。故从植物组织中分离和鉴定质膜蛋白至关重要。接下来我们将讨论从植物组织中分离质膜蛋白的常用方法，以及它们的优点和缺点和应用案例。

差速离心法

差速离心分离法是分离质膜蛋白最常用的方法之一。该方法涉及不同速度依次离心，从匀浆的植物组织中制备出沉淀的质膜，然后使用密度梯度超离心法或亲和层析法进一步纯化。该方法具有产率高、成本低的优点，但工艺复杂、耗时长，且需要专用设备，如超高速离心机，匀浆仪等。此外，此方法需要大量的样本，不适于珍贵微量样品，且交叉污染也是一个常见的问题(1)。


水相两相分配法

另一种分离质膜的常用方法是水相两相分配法(ATPP)，它是利用聚合物溶液形成的两个不同水相之间蛋白质的差异而分离。质膜蛋白可以从上相提取，需要清楚地将上相和下相分离，但是操作极为困难，非常易形成交叉污染(2)。


柱式分离法

植物质膜蛋白分离的新技术是利用离心管柱法（Invent Cat# SM-005-P），该方法使用特殊设计的离心管柱和专有的无表面活性剂缓冲体系，可以在不使用超速离心机的情况下，快速分离天然形式的质膜囊泡和相关蛋白。这种方法只需要一台台式离心机，起始材料仅需200-300mg的植物组织，即可在1小时左右完成质膜蛋白的分离提取。

柱式法应用案例一

Brillada C.等人的一项研究利用免疫印迹检测PIP2;2研究了Exo70B2与拟南芥幼苗免疫信号传导之间的关系。利用离心管柱法(SM-005-P)，分别从GFP-Exo70B2 WT、GFP-Exo70B2 AA和GFP-Exo70B2 DD的八日龄幼苗中富集质膜蛋白部分。获得的蛋白质样品，用IB进行抗GFP和抗PIP2;2分析;考马斯亮蓝(CBB)表示相等的上样量。结果显示（Fig1），他们能够显著富集质膜蛋白，并与可溶性组分有效分离，证实了GFP-Exo70B2与质膜（PM）的关联，而磷酸化的S554/567A显示在PM中积累减少(3)。


Fig1. Ser554 and Ser567 regulate Exo70B2 localization in root hairs.


柱式法应用案例二

Laohavisit A.等人利用离心管柱法提取质膜蛋白研究了醌信号转导和CARD1功能在寄生和非寄生植物中的作用(4)。利用SM-005-P将拟南芥幼苗分离为质膜（PM）、细胞器膜(OM)和可溶性组分(SF)，分别用CARD1、AHA1 (质膜内参)、SMT1 (内质网内参)和RbcL(可溶性组分内参)进行 Western blotting检测。结果表明（Fig2），PM蛋白显著富集，CARD1主要存在于PM部位，PM与可溶性部位之间没有交叉污染。


Fig2.CARD1 is predominantly localized to the plasma-membrane enriched fraction.


柱式法应用案例三

Yiqin Wang等人利用离心管柱法提取质膜蛋白研究了NB-ARC蛋白和半胱氨酸受体样蛋白RMC引发水稻细胞死亡的机制（5）。使用SM-005-P将noe2幼苗叶片进行组分分离后，用WB对总蛋白(T)、上清(S)和质膜(PM)组分分别检测RMC是否存在，用质膜蛋白H+ATPase作为质膜蛋白质部分内参，UDPase作为细胞质内参，Rubisco大亚基的Ponceau染色作为上样对照。RMC，为全长RMC，secRMC，为分泌RMC。实验结果表明（Fig3），质膜（PM）蛋白标志物(H+ATPase)比细胞总裂解物(T)明显富集，且PM与可溶性上清液(S)之间的交叉污染极低。

Fig3. Co-expression of RlS1-D and RMC induced cell death and changed the pattern of subcellular localization.

以上应用案例表明Invent柱式法可以有效稳定的将植物质膜蛋白分离，并适用于各类下游实验。除以上案例中样品，Invent离心管柱法植物质膜分离试剂盒已成功应用于多种植物，包括烟草(7)、桑树(8)、黄瓜叶片(9)、月季 (Rosa hybrida cv. Samantha) (10)， PUT3OE转基因株系(12)，伴矿景天(13)，大豆(14)等。分离出的质膜蛋白除了可用于WB，IP，Co-IP等实验，也可用于蛋白质组学质谱分析等应用(6,11,13,14)。

       综上所述，离心管柱法植物质膜分离试剂盒已被证明是一种简单、快速、一致性好的质膜蛋白分离方法，其有效性已被广泛的植物物种大量研究证实。如果您正在寻求植物质膜的分离方法，柱式法是您更好的选择！

参考文献：

1. Dong, C. H., & Fu, Y. P. (2015). Isolation of plasma membrane proteins from plants. In Plant signal transduction (pp. 123-133). Springer, Cham.

2. Walter, H. (Ed.). (2012). Partitioning in aqueous two–phase system: theory, methods, uses, and applications to biotechnology. Elsevier.

3. Brillada, C., Teh, O. K., Ditengou, F. A., Lee, C. W., Klecker, T., Saeed, B., ... & Hoehenwarter, W.(2020). Exocyst subunit Exo70B2 is linked to immune signalling and autophagy. The Plant Cell.

4. Laohavisit, A., Wakatake, T., Ishihama, N., Mulvey, H., Takizawa, K., Suzuki, T., & Shirasu, K.(2020). Quinone perception in plants via leucine-rich-repeat receptor-like kinases. Nature, 1-6.

5. Wang, Y., Teng, Z., Li, H., Wang, W., Xu, F., Sun, K., ... & Tang, J. (2022). An activated form of NB-ARC protein RLS1 functions with cysteine-rich receptor-like protein RMC to trigger cell death in rice. Plant Communications, 100459.

6. Rehman, H. M., Chen, S., Zhang, S., Khalid, M., Uzair, M., Wilmarth, P. A., ... & Lam, H. M.(2022). Membrane Proteomic Profiling of Soybean Leaf and Root Tissues Uncovers Salt-Stress-Responsive Membrane Proteins. International Journal of Molecular Sciences, 23(21), 13270.

7. Wang, Q., Li, Y., Ishikawa, K., Kosami, K. I., Uno, K., Nagawa, S., ... & Kawano, Y. (2018).Resistance protein Pit interacts with the GEF OsSPK1 to activate OsRac1 and trigger rice immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences, 115(49), E11551-E11560.

8. Wang, Q., Li, Y., Ishikawa, K., Kosami, K. I., Uno, K., Nagawa, S., ... & Kawano, Y. (2018).Resistance protein Pit interacts with the GEF OsSPK1 to activate OsRac1 and trigger rice immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences, 115(49), E11551-E11560.

9. Ma, S., Sun, L., Sui, X., Li, Y., Chang, Y., Fan, J., & Zhang, Z. (2019). Phloem loading in cucumber:combined symplastic and apoplastic strategies. The Plant Journal, 98(3), 391-404.

10. Zhang, S., Feng, M., Chen, W., Zhou, X., Lu, J., Wang, Y., ... & Gao, J. (2019). In rose, transcription factor PTM balances growth and drought survival via PIP2; 1 aquaporin. Nature plants, 1.

11. Zhang, S., Feng, M., Chen, W., Zhou, X., Lu, J., Wang, Y., ... & Gao, J. (2019). In rose, transcription factor PTM balances growth and drought survival via PIP2; 1 aquaporin. Nature plants, 1.

12. Chai, H., Guo, J., Zhong, Y., Hsu, C. C., Zou, C., Wang, P., ... & Shi, H. The plasma‐membrane polyamine transporter PUT3 is regulated by the Na+/H+ antiporter SOS1 and protein kinase SOS2.New Phytologist.

13. Zhu, Y., Qiu, W., Li, Y., Tan, J., Han, X., Wu, L., ... & Zhuo, R. (2021). Quantitative proteome analysis reveals changes of membrane transport proteins in Sedum plumbizincicola under cadmium stress. Chemosphere, 132302.

14. Rehman, H. M., Chen, S., Zhang, S., Khalid, M., Uzair, M., Wilmarth, P. A., ... & Lam, H. M.(2022). Membrane Proteomic Profiling of Soybean Leaf and Root Tissues Uncovers Salt-Stress-Responsive Membrane Proteins. International Journal of Molecular Sciences, 23(21), 13270.




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