脂肪组织由脂肪细胞组成，周围有结缔组织和细胞外基质，并含有高水平的脂质。这些成分会干扰蛋白质的提取，特别是脂质的存在，在蛋白提取过程中会与蛋白质共沉淀，导致蛋白质样品的产量低，质量差。 脂肪组织的位置和生理状态不同，脂肪组织蛋白质组成也不同，具有复杂性，提取过程也更加复杂。因此，从脂肪组织中提取总蛋白被大家一直认为很困难。
目前从脂肪组织中提取总蛋白，大家通常会使用化学裂解（RIPA缓冲液）、机械匀浆、超声和有机溶剂萃取法。 然而，这些方法往往涉及使用大量的去垢剂，导致蛋白质会被封存到胶束中，使蛋白质损失。此外，蛋白质样品中脂质的存在会明显影响SDS-PAGE中观察到的条带模式。
Zakharchenko等人[1]进行了一项研究，比较了不同提取缓冲液对从乳腺组织中提取的蛋白质质量的影响。他们发现，无论使用何种提取缓冲液，在SDS-PAGE中，蛋白质条带都出现了一定程度的弥散。蛋白质的产量一般较低，在某些情况下，蛋白质的很大一部分丢失了(见Fig1)。
Fig1.Lane assignment from left to right: Urea-containing extraction buffer, 1% Triton-X 100, RIPA buffer, 1% SDS followed by precipitation, and 1% SDS extraction (last lane)
所以提取脂肪组织总蛋白时缓冲液组成、匀浆的方法和离心参数等因素十分重要。
Invent Minute TM 柱试法脂肪总蛋白提取剂盒(CAT#:AT-022)为从脂肪组织中提取总蛋白提供了一种简单快速的解决方案，产量高，结果可重复性好。 试剂盒利用不含表面活性剂的缓冲液体系，防止蛋白质在脂肪组织匀浆过程中滞留在胶束中。将匀浆的水油乳状液短暂冷冻，然后通过离心管柱，即可有效的将水相中的蛋白质从油相中分离出来。除去样品中的脂质后，总蛋白被有效溶解提取出。柱式法可显著提高脂肪蛋白质提取的产量和质量。以下为试剂盒使用数据。
在一项调查PM2.5暴露与肥胖和2型糖尿病风险增加之间相关的研究[2]中，使用AT-022试剂盒从小鼠模型中分别提取内脏白色脂肪组织(vWAT)、棕色脂肪组织(BAT)和皮下白色脂肪组织(scWAT)。 提取的蛋白质用不同的抗体进行Western印迹分析。 如Fig2所示，所有的蛋白质条带都清晰干净，背景很低。
Fig2.Western blot assays and quantification for protein expressions of peroxisome proliferatoractivated receptor gamma (PPARγ) and CCAAT/enhancer-binding protein alpha (C/EBPα) in visceral WAT (vWAT), uncoupling protein-1 (UCP1) in BAT, and p-AMPK/AMPK in scWAT.
在Jahandideh, F. et al.[3]进行的另一项研究中，研究了蛋清水解物(EWH)增强胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性的机制。采用AT-022试剂盒从腹膜后脂肪中提取总蛋白。采用LICORE检测系统进行半定量Western blotting检测Akt和磷酸化Akt的相对表达量。结果表明（如Fig3），EWH通过激活Akt提高了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感性。准确的半定量蛋白质条带需要清晰和明确的条带，所以蛋白质的质量至关重要。
Fig3.Tissue insulin sensitivity assessed by phosphorylation of Akt.
03
Oldoni F.等人[4]利用缺乏肝脏特异性A8 (Ls-A8-/-)或脂肪特异性A8 (As-A8-/-)的小鼠，探索了血管生成素样蛋白(A8)和甘油三酯代谢之间的关系。采用AT-022试剂盒从皮下白色脂肪组织(WAT-SQ)和棕色脂肪组织(BAT)中提取总蛋白。提取的蛋白用抗A8抗体和内参蛋白calnexin (CANX)进行检测。如Fig4所示，A8在肝特异性小鼠脂肪组织中表达，而在脂肪特异性小鼠的两种脂肪组织中均不存在。A8条带和CANX条带清晰，表明提取的蛋白质量高。
Fig4.Immunoblot analysis of A8 in tissue lysates from WAT-SQ and BAT (25 μg each) of chow-fed male mice (n=3-4/genotype, 12-13 wk) was performed as described in the Methods.
由于脂肪组织成分复杂，脂质含量高，从脂肪组织中提取总蛋白是一个具有挑战性的过程。使用合适的方法会使得脂肪蛋白提取变得不再困难。Invent柱式法脂肪总蛋白提取试剂盒（AT-022）可以快速和简单的从脂肪组织及细胞中提取出适合下游分析的高质量蛋白质样品。 不但可用于Western blotting等最常用的下游应用，提取的蛋白质也可用于ELISA[5]。AT-022试剂盒应用的样品除了小鼠和大鼠等实验室动物，已经成功地应用于包括人类[6,7]、猪[8]、奶牛[9]和培养的脂肪细胞[10]在内的各类物种，是脂肪蛋白质研究不可或缺的好工具！
参考文献：
1. Zakharchenko, O. et al. (2011) Optimized Protocol for Protein Extraction from the Breast Tissue that is Compatible with Two-Dimensional Gel Electrophoresis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research 2011:5 37–42.
2. Wang, N., Ma, Y., Liu, Z., Liu, L., Yang, K., Wei, Y., ... & Wen, D. (2019). Hydroxytyrosol prevents PM2. 5-induced adiposity and insulin resistance by restraining oxidative stress related NF-κB pathway and modulation of gut microbiota in a murine model. Free Radical Biology and Medicine,
141, 393-407. Zani, S. (2019).
3. Jahandideh, F., de Campos Zani, S. C., Son, M., Proctor, S. D., Davidge, S. T., Chan, C. B., & Wu,J. (2019). Egg white hydrolysate enhances insulin sensitivity in high fat diet induced insulin resistant rats via AKT activation. British Journal of Nutrition, 1-25.
4. Oldoni, F., Cheng, H., Banfi, S., Gusarova, V., Cohen, J. C., & Hobbs, H. H. (2020). ANGPTL8 has both endocrine and autocrine effects on substrate utilization. JCI insight, 5(17).
5. Tu, J., Zhu, S., Li, B., Xu, G., Luo, X., Jiang, L., ... & Chen, C. (2020). Gegen Qinlian Decoction Coordinately Regulates PPARγ and PPARα to Improve Glucose and Lipid Homeostasis in Diabetic Rats and Insulin Resistance 3T3-L1 Adipocytes. Frontiers in Pharmacology, 11.
6. Tu, J., Zhu, S., Li, B., Xu, G., Luo, X., Jiang, L., ... & Chen, C. (2020). Gegen Qinlian Decoction Coordinately Regulates PPARγ and PPARα to Improve Glucose and Lipid Homeostasis in Diabetic Rats and Insulin Resistance 3T3-L1 Adipocytes. Frontiers in Pharmacology, 11.
7. Li, X., Zhang, X., Shen, Z., Chen, Z., Wang, H., & Zhang, X. (2022). GnRH receptor mediates lipid storage in female adipocytes via AMPK pathway. Int J Med Sci, 19(9), 1442-1450.
8. Zheng, Q., Lin, J., Huang, J., Zhang, H., Zhang, R., Zhang, X., ... & Song, R. (2017). Reconstitution of UCP1 using CRISPR/Cas9 in the white adipose tissue of pigs decreases fat deposition and improves thermogenic capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences, 201707853.
9. Zhang, F., Li, D., Wu, Q., Sun, J., Guan, W., Hou, Y., ... & Wang, J. (2019). Prepartum body conditions affect insulin signaling pathways in postpartum adipose tissues in transition dairy cows.Journal of Animal Science and Biotechnology, 10(1), 38.
10. Chen, T. X., Cheng, X. Y., Wang, Y., & Yin, W. (2018). Toosendanin inhibits adipogenesis by activating Wnt/β-catenin signaling. Scientific Reports, 8(1), 4626.Top of Form.
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