“考古”44年前第一次WB是怎样做的?
栏目:专题    日期:2023-08-11    来源:英文特

被称为“玄学”的WB已经有了44年的历史,它到底是谁发明的?第一次WB又是怎样做的?它的名字是怎么来的?带着好奇我们一起来“考古”世界的第一次WB吧!



穿越线

1979年,瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所的Harry Towbin【1】 第一次详细的描述了WB实验过程,当时的实验室条件有限,抗体很难获得,他们就将纯化的蛋白注射到小鼠或山羊体内自行制作抗体。我们现在说的“三明治夹”当时是把凝胶和硝酸纤维素膜,夹在两片粗粒冲刷垫和用于结构支撑的废弃吸头盒托盘中,用橡皮筋绑在一起。检测时使用的放射性同位素也是自行制作,通过“氯胺T法”将自身抗体标记为碘-125,并将标记的印迹曝光6天才完成了整个实验。

Western Blot这个名称的由来也很有意思。Harry Towbin最初并没有真正命名这种方法,只是简单地称它是一种“电泳印迹技术”,直到1981年,W.Neal Burnette【2】将其命名沿用至今。“印迹”是指生物样品从凝胶转移到膜上并在膜表面进行后续检测的过程。最开始做印迹工作的是一个叫做Edwin Southern的科学家,印迹的对象是DNA,他把这种技术称为Southern Blot。后来又相继出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA的Northern Blot,一个就是针对蛋白质的Western Blot。



第一次WB过程



免疫原和免疫过程:

首先将大肠杆菌核糖体蛋白L7和L12提取,并通过羧甲基纤维素和DEAE-纤维素离子交换层析纯化。用完全弗氏佐剂乳化的蛋白质在山羊皮下多个部位注射,产生抗体,这只动物在第117天被放血。
将鸡肝核糖体的亚基,与完全弗氏佐剂乳化,分别在BALB/c小鼠腹腔和皮下注射。在第33,57,58和59天腹腔注射400ug核糖体盐水。这些动物在第71天被放血。

电泳印迹过程:

蛋白质首先在尿素存在下在二维或对应于相同体系第二维的一维板状凝胶中进行电泳。 然后将蛋白质转移到硝化纤维素片上,所使用的物理组件以图解方式显示(Fig 1)。 将硝化纤维素片(0.45um孔径,卷装,Millipore)用水短暂润湿,并将其放在由塑料网格支撑的清洁垫上。 将待转印的凝胶放在硝酸纤维素膜片上,并注意去除所有气泡。 将第二个垫子和塑料网格支撑依次添加,并用橡皮筋将所有层周围固定。 这样将凝胶牢固且均匀地压在硝化纤维素膜片上。 将该组件放入电泳转印槽中,硝化纤维素膜片面对阴极。 转印槽中含有0.7%的醋酸,施加6V/cm的电压1小时。
使用十二烷基硫酸钠代替尿素时进行聚丙烯酰胺电泳,除电极极性相反,电极缓冲液为25 mM Tris-192 mM甘氨酸/20%(vol/vol)甲醇,pH8.3外,方法与上述相同。                               

FIG. 1. Assembly for electrophoretic blotting procedure.

1,Electrodes of destainer(电极); 2, elastic bands(橡皮筋); 3, disposable pipette-tip tray(废弃的吸头盒托盘);4, nitrocellulose sheets(硝酸纤维素膜); 5, polyacrylamide gel(聚丙烯酰胺凝胶); 6, Scotch-Brite pads(Scotch-Brite垫)


蛋白质染色:

印迹膜用amido black(0.1%在45%甲醇/10%醋酸中)染色,并用90%甲醇/2%醋酸脱色。

蛋白质在硝酸纤维素膜上的免疫学检测:

电泳印迹膜(通常不用amido black染色)用3%牛血清白蛋白在生理盐水(0.9%NaCl/10 mM Tris-HCl,pH7.4)中,40℃,浸泡1小时,以封闭额外的蛋白质结合位点。在生理盐水中漂洗后,用3%牛血清白蛋白适当稀释抗血清在生理盐水中孵育,该抗血清还含有载体血清。
将膜片在生理盐水中洗涤(大约在30分钟内总共5次),然后用二抗(指示剂)进行孵育,检测一抗血清的免疫球蛋白。
用碘-125标记羊抗鼠IgG作为抗体指示。骨髓瘤蛋白利用琼脂糖亲和层析纯化,用改进的氯胺T法在0.5mL、0.5mg IgG和1mCi Na125I室温下标记60秒。碘-125标记标记的IgG在含3%牛血清白蛋白和10%山羊血清的生理盐水中稀释至106 cpm/ml,该溶液3 ml用于100 cm2的硝酸纤维素膜片。 室温下在0.01%NaN3孵育6小时。 电泳印迹在生理盐水中洗涤(30分钟内共更换5次),并用吹风机彻底干燥。 用Kodak X-OMAT R胶片曝光6天。

荧光素-和辣根过氧化物酶-结合兔抗山羊IgG在使用前根据制造商的说明进行重组。荧光素结合抗体在含3%牛血清白蛋白和10%兔血清的生理盐水中稀释1:50。在室温下孵育30分钟后,按上述方法洗涤印迹,并用宝丽来相机在长波紫外光下通过黄色滤光片进行检查或拍照。

 辣根过氧化物酶结合的IgG制剂在含3%牛血清白蛋白和10%兔血清的生理盐水中稀释1:2000。 将印迹在室温下温育2小时,并按上述方法洗涤。 对于显色反应,将印迹浸泡在25ug邻二苯二胺/0.01%H202/10mM Tris-HCI,pH7.4溶液中,用水洗20-30分钟后终止反应。印迹夹在滤纸之间干燥,干燥可大大减少背景。印迹保存在避光处。

Fig2.Detection of E. coli ribosomal proteins L7 and L12 by (A) horseradish peroxidase- and (B) fluorescein-conjugated antibodies. 



今天

看完44年前WB的实验过程,条件如此艰难,仍然做出了成功的结果,不禁感叹前人的伟大!如今WB这项伟大的发明已经成为我们蛋白质研究不可或缺的强大工具,用于研究已确定蛋白,获得蛋白质的定性和半定量数据。随着科技发展,不断涌现出新技术,让WB实验变得更加易操作,结果更优质。如Invent公司开发的柱式法蛋白质提取工具,弥补了传统裂解液蛋白提取方法中蛋白丢失的缺点,让蛋白质的样品质量大幅度提升的同时,使得蛋白质制备变得更加快捷。除此Invent柱式法还可将样品按照亚细胞结构进行蛋白质分离,分离出不同组分的蛋白可分别用于WB检测,可以进行蛋白质定位,蛋白质转运等更深入的研究。



参考文献:

1.Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS. 1979, 76: 4350-4354.

2.Burnette WN. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 1981 Apr;112(2):195-203. doi: 10.1016/0003-2697(81)90281-5. PMID: 6266278.




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