英文特生物技术(北京)有限公司 inventbiotech 欢迎您...

蛋白质-DNA互作研究新方法——Cut-Tag，了解一下！

栏目：技术日期：2021-12-24 来源：admin

在生物学研究中， DNA和蛋白质之间的相互作用（DNA-Protein Interaction，DPI）对于调控基因的表达、复制、重组和修复发挥着重要作用，研究DPI是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。

对于DPI的研究，科学家们开发了众多方法，比如凝胶阻滞实验、DNase 1足迹实验、甲基化干扰实验和ChIP-Seq实验等。

2019年Steven Henikoff教授于Nature Communication 发表了题为CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells的文章，该文中介绍了一种新的DPI研究技术——Cleavage Under Targets and Tagmentation（Cut-Tag）。

Cut-Tag实验基本步骤（如下图）：

（1）细胞与伴刀豆蛋白A磁珠结合，以便进行细胞处理并在每次洗涤后去除液体；

（2）对细胞进行透化处理后，一抗结合目的蛋白（特异性结合），二抗（IgG）结合一抗（放大信号）；

（3）使用预载有测序adapters的过量pA-Tn5融合蛋白孵育细胞，使其与抗体复合物结合；

（4）通过加入Mg²⁺激活Tn5转座体，Tn5转座酶片段化目的DNA并完成NGS加接头过程；

（5）纯化DNA富集片段制备DNA文库，后续进行高通量测序。

图片来源：activemotif

Cut-Tag技术是一种研究DPI的新型分子生物学方法，相比于目前DPI研究的传统方法ChIP-Seq具有以下的优势：

1

样品起始量需求低

Cut-Tag技术中pA-Tn5复合物可直接在抗体结合位点切割DNA，不需要染色质抽提，通常60个-1*10⁵个细胞即可，而ChIP-Seq实验中的免疫沉淀步骤为获得足够多的靶蛋白则需要大量的细胞（约10⁶至110⁷个细胞）；

2

无需交联或超声处理

Cut-Tag技术在天然细胞或细胞核上进行，无需ChIP-Seq实验中的交联和超声处理步骤，ChIP-Seq实验中过度交联或超声可能会影响抗原表位，导致抗体-蛋白质-DNA复合物无法被免疫沉淀；

3

省时高效

相对于步骤繁琐的ChIP-Seq实验，Cut-Tag技术更加省时，整个实验过程在一个管中即可进行。标记步骤同时涉及染色质剪切和测序文库适配器插入，适合高通量实验；

4

测序深度需求低

Cut-Tag技术分离出的DNA序列较短，远远低于ChIP-Seq实验的测序深度要求—— ChIP-Seq技术通常每个样本需要30-50百万reads，但Cut-Tag仅需3-5百万reads即可获取可靠的数据。

此外，Cut-Tag技术还具有信噪比高、重复性好、可用于单细胞水平测序等优点。

Cut-Tag技术可以直接用细胞作为起始材料，但如使用细胞核作为起始材料可：（1）减少透化处理步骤；（2）难获取单细胞的组织样品也可进行检测；（3）减少因细胞聚集对下游实验的影响。故使用细胞核作为起始原料可大大提高该方法的实用性。

传统方法获取的细胞核，通常存在核膜被破坏，核基质泄露、核聚集等问题，使得无法与Cut-Tag技术兼容。推荐使用Invent 无表面活性剂完整的核分离试剂盒（cat#NI-024），本方法不使用任何表面活性剂，也无需组织匀浆，利用离心管柱技术可从动物细胞或组织（新鲜或冷冻）分离出完整的单个细胞核（如下图），保留了核膜的完整性并克服了核聚集问题，获取的细胞核材料非常适用于Cut-Tag实验。

注：若非立即进行Cut-Tag实验，可使用Invent Minute^TM抗聚集细胞核储存液（cat#WA-014）(new)，分离得到的细胞核可在本储存液中4℃放置长达一周或在-80℃下放置长达12个月，且形态不会发生显著变化。

尽管Cut-Tag技术很有前途，但也存在一定的局限性，使其无法完全取代ChIP-Seq技术：

1

未交联或天然条件并不适合所有实验

许多转录因子与DNA结合较弱，对于这些情况，染色质交联和超声处理是检测DPI的必须步骤；此外大多数适用于ChIP的抗体经验证可在交联条件下工作，在天然条件下可能无法正常工作；Cut-Tag需要彻底的抗体验证，以确保在未交联条件下的特异性和灵敏度；

2

可能会引入偏差

Cut-Tag技术中使用Tn5转座酶对染色质开放区域具有高亲和力，更适合分析与基因组活跃转录区域相关的组蛋白修饰或转录因子，而不是非常适合分析沉默或含有异染色质的基因组区域。

总的来说，Cut-Tag是一项很有前途的技术，对基因调控、表达遗传等领域的研究具有革命性的意义。虽然目前还存在一定的局限性，但其成本效益及其适用于单细胞/单细胞核分析的适应性也可能使其成为高通量检测的一种选择。相信不久，Cut-Tag技术也会像ChIP-Seq一样得到广泛的应用。

参考文献：

[1]Hatice S. Kaya-Okur, Steven J. Wu, Christine A.et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature communications. 2019, 10(1):1930.

[2]Anne-Sophie Ay-Berthomieu, Ph.D. Comprehensive Guide to Understanding and Using CUT&Tag Assays.2020.11

站内热点

版权声明

版权声明网站所载数据，包括但不限于文字报导、商标、图表图片、设计、网页上的照片、产生网页的程式码及其他构成这些网页内容的载体、文件及设计，均受到《中华人民共和国著作权法》、《中华人民共和国商标法》及其他法律法规和国际条约的保护。上述内容的知识产权属于本公司及网站，或其他授权本网站使用的内容提供者。任何个人或企业不得以商业目的转载使用，其它媒体或网站转载请注明来源于英文特生物技术（北京）有限公司网站www.inventchina.cn。非经本公司同意或授权，不得对本网站内容进行修改、复制、抄袭、剽窃、贩卖、展示、公开、散播或是将其用于任何商业目的。补充：① 本网站之上述声明以及其解释权、修改权、更新权均属本公司；② 本公司的浏览人员、加盟和参与本公司活动的人员、本公司项目服务的客户、与本公司进行合作的的单位和个人均在本公司“用户”之列，只有在接受和认可本声明的各项条款的条件下才能使用和浏览本网站；③ 涉及专项咨询或者针对特定客户、或者大型的专项服务，以双方签订的书面协议为权利、义务、责任依据；④ 未经本站声明明确授予的任何权利均予保留；⑤ 本站点所提到的真实的公司和产品的名称可能是其各自所有者的商标。