01信号通路
信号通路是指当细胞里要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根据这种信息来做出反应的现象。
02
NF-ĸB信号通路
NF-κB（核因子-κB）是一种蛋白复合物，是细胞内重要的核转录因子。NF-κB信号通路是生物体内一种重要的信号传导系统，它在调节免疫应答、炎症反应、细胞生存和增殖等多种生理过程中发挥着关键作用。NF-κB几乎存在于所有动物细胞类型中。经研究发现NF-κB过度激活，与人类许多疾病如类风湿关节炎、心脏与脑部疾病的炎症变化等相关，因此通过药物来抑制NF-κB信号通路是很多科研者的研究方向。
03 NF-κB信号通路主要成员
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NF-κB家族成员：包括p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2）、RelA（p65）、c-Rel和RelB。p52和p50分别由前体蛋白p100、p105裂解而成，前体蛋白的C端有类似于NF-κB抑制剂（IκB）的结构。这个家族的大多数成员(RelB是一个例外)可以形成同型二聚体，也可以形成异二聚体。NF-κB最常见的激活形式是由p50或p52亚基和p65组成异二聚体。
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IκB蛋白家族：包括经典的IκBα、IκBβ、IκBε，以及非典型的BCL-3、IκBζ、IκBNS等。IκB蛋白在静息状态下与NF-κB结合，抑制其活性。
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IKK复合物：由催化亚基IKKα、IKKβ和调节亚单位IKKγ（NEMO）组成，是激活NF-κB的关键酶。
04 NF-κB信号通路分类
NF-κB信号通路的激活主要通过两种途径：经典（典型）途径和非经典（备选）途径。
NF-κB信号通路的经典途径由促炎细胞因子等激活，IKK复合物使IκB蛋白磷酸化降解，释放NF-κB入核启动基因转录，正向调控IKK复合物激活，负向调控IκBα重新合成；非经典途径由特定受体激活激酶NIK，激活IKKα复合物，使p100磷酸化加工为p52，产生的p52/RelB复合体入核诱导基因表达，两者均受多种翻译后修饰调控。
NF-κB的经典信号通路和非经典信号通路的主要区别
经典信号通路中，IκB蛋白的降解使NF-κB二聚体得到释放。而在非经典信号通路中，则是通过p100到p52的加工处理，使信号通路激活。
05 NF-κB信号通路的激活
Canonical and non-canonical NF-κB pathways
图片来源：doi:10.1038/nri.2017.52
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经典途径：
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在受到促炎细胞因子、脂多糖（LPS）、生长因子等刺激时，IKK复合物被激活，使IκBα、IκBβ等IκB蛋白磷酸化。
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磷酸化的IκB蛋白被泛素化并被蛋白酶体降解，释放出NF-κB复合体。
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活化的NF-κB复合体进入细胞核，与DNA上的κB位点结合，启动靶基因的转录。
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非经典途径：
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由特定的受体（如LTβR、CD40等）激活激酶NIK，进而激活IKKα复合物。
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IKKα复合物使NF-κB2 p100的C端残基磷酸化，导致其泛素化和蛋白酶体加工为NF-κB2 p52。
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产生的NF-κB
p52/RelB复合体进入细胞核，诱导目的基因的表达。
信号通路的调控过程
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正向调控：
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IKK复合物的激活：在经典途径中，受体激活后，接头蛋白如TRAF2/5等被募集，进而激活IKK复合物。
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NIK的积累与激活：在非经典途径中，NIK的积累和激活是关键步骤，NIK激活IKKα复合物，从而启动下游信号。
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负向调控：
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IκBα的重新合成：NF-κB进入细胞核后，会诱导IκBα基因的表达，新合成的IκBα会重新与NF-κB结合，将其滞留在细胞质中，形成负反馈环。
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磷酸化和泛素化修饰：NF-κB的活性还受到磷酸化、乙酰化、糖基化等翻译后修饰的调控，这些修饰可以影响其进入细胞核的能力或与DNA的结合能力。
06 NF-κB信号通路验证
经典信号通路，静息细胞中，NF-κB主要定位于细胞质，与其抑制剂NF-κB抑制剂（IκB）结合，少量以非活性复合物位于细胞核。在激活的细胞中，IκB被IKK磷酸化后降解，释放的NF-κB 移位进入细胞核，与目的基因结合激活相关基因转录。NF-κB的转录活性由p65亚基的磷酸化或乙酰化的完全激活所调控。故使用WB检测NF-κB p65是研究NF-κB信号通路不可或缺的指标。
如以下案例：
Western blot for NF-κB p65 expression in cytoplasmic and
nuclear fractions of VSMCs treated with TNF-α for 30 min. Ad-Vector- or Ad-circ-Sirt1-infected VSMCs (E). si-Con-
or si-circ-Sirt1-transfected VSMCs (F).
图片来源：Kong, P., Yu, Y., Wang, L., Dou, Y. Q., Zhang, X. H., Cui, Y., ...
& Cui, W. (2019). circ-Sirt1 controls NF-κB activation via sequence-specific interaction and enhancement of
SIRT1 expression by binding to miR-132/212 in vascular smooth muscle cells.
Nucleic Acids Research.Doi: 10.1093/nar/gkz141
Representative immunoblot of nuclear p65,
cytoplasmic p65, p-IκBα and IκBα in RAW264.7 cells that were pretreated with FW1256 (200 μM) for 30 min before stimulationfor 60
min with LPS (1 μg/ml).
图片来源：Huang, C. W., Feng, W., Peh, M. T., Peh, K., Dymock, B. W., &
Moore, P. K. (2016). A novel slow-releasing hydrogen sulfide donor, FW1256, exerts
anti-inflammatory effects in mouse macrophages and in vivo. Pharmacological
Research.
07验证注意事项
• 胞质胞核分离
NF-κB通路是研究最为清晰的信号通路之一，在经典通路中p65的磷酸化以及核易位被认为是NF-κB激活所必须的。WB分别检测胞浆及胞核内p65的含量变化，是NF-κB活性检测中说服力比较强的常用方法。故将样品进行胞质胞核分离必不可少，两组分间无交叉污染尤为重要。Invent柱式法胞质胞核分离试剂盒（Cat#SC-003）可以帮您解决这个棘手问题，在5分钟内可将细胞样品的胞质胞核组分分离，且交叉污染低。（上述案例均使用本试剂盒分离胞质胞核组分）。分离后的胞质胞核组分，可用于WB，IP，CO-IP，ELISA或RNA提取等下游应用。
• 由于NF-κB p65存在多种翻译后修饰形式，
例如磷酸化、 泛素化和乙酰化等。因此在WB实验时，NF-κB p65蛋白大小和条带数目会受这些翻译后修饰影响，可能会存在多条带现象。
• NF-κB p65的翻译后修饰可能需要条件诱导，
例如使用Calyculin A和TNF-a刺激细胞后，可检测到536位丝氨酸被磷酸化修饰的NF-κB p65蛋白。WB条带信号弱或无条带时候，可考虑使用条件诱导。
• 尽量使用新鲜制备的蛋白样品，避免因样品冻存导致的磷酸化修饰减弱。进行磷酸化修饰检测时，请先确认细胞内NF-κB p65总蛋白的含量。
• 在制备蛋白样品时添加磷酸酶抑制剂，乙酰酶抑制剂或者复合蛋白酶抑制剂以避免蛋白降解。
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